Kỹ thuật chuyên sâu

         Giải trình tự trên máy CEQ 8800 là một hệ thống máy giải trình tự động. Máy hoạt động dựa trên nguyên lý của phương pháp Sanger. Trong đó các dideoxynucleotide triphosphate có cấu trúc hóa học mất gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose làm cho dNTP kế tiếp không thể gắn vào được, do đó sẽ kết thúc phản ứng kéo dài chuỗi. Kết quả là sẽ tạo ra những đoạn DNA có chiều dài khác nhau, tương ứng với các trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc. Các ddNTP được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Sau khi điện di trên gel polyacrylamide, các vạch điện di trong mao quản sẽ được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser của máy. Hệ thống nhận diện tín hiệu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, G, C.
             Xác định đột biến kháng thuốc của virus viêm gan B: các đột biến một số vị trí nhất đinh tại vùng domain reverse transcriptase (vùng rt) của gen HBV polymerase được chứng mình có vai trò gây nên tính kháng thuốc của virus HBV. Để xác định đột biến kháng thuốc, kỹ thuật PCR lồng (nested PCR) được phát triển để nhân vùng rt với các cặp mồi như sau: cặp mồi PCR vòng ngoài (outer PCR) gồm HBV-69 và HBV-70, cặp mồi PCR vòng trong (inner PCR) gồm HBV-61 và HBV-17. Sản phẩm PCR vòng trong được tinh sạch để giải trình tự. Trình tự đoạn gene đích sau khi giải sẽ được so sánh với các trình tự tham chiếu của các chủng hoang dại và các trình tự tham chiếu khác có kiểu gen khác nhau để so sánh và tìm kiếm các đột biến kháng thuốc dựa vào phần mềm Bioedit.
            Ví dụ trong hình dưới trình tự của bn HBV-NgDH2 được phân tích đột biến kháng thuốc với các trình tự tham chiếu và trình tự hoang dại cho thấy xuất hiện các đột biến kháng thuốc.

            
      
Xác định kiểu gen HCV: RNA tổng số tách từ huyết thanh bệnh nhân nhiễm HCV được tổng hợp cDNA bằng bộ kít QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAgen). Kỹ thuật RT-PCR lồng khuếch đại một phần gene core protein của bộ gen HCV bằng 2 cặp mồi Pre1as và Pre2as, và Pre3as và Pre5as. Sản phẩm PCR của cặp mồi Pre3as và Pre5as, được tinh sạch và giải trình tự. Trình tự thu được phân tích cùng với trình tự tương ứng của các trình tự tham chiếu với các kiểu gen HCV khác nhau bằng phần mềm Bioedit và xây dựng cây phân loài bằng phần mềm Mega5. Xác đinh kiểu gen HCV là xét nghiệm bắt buộc với các bệnh nhân điều trị bằng phác đồ kháng virus. Kiểu gen HCV có vài trò quan trọng trong tiên lượng và điều trị. Kết quả xác đinh kiểu gen HCV được minh họa ở hình dưới. Bệnh nhân Nguyễn Ng.H được xác định là kiểu gen 1, dưới kiểu gen là 1a.

 




Liên hệ: Khoa Sinh học Phân tử
Điện thoại:  04.6278.4169